原核蛋白表达技术服务

细菌表达系统是一种比较理想的蛋白质表达系统，它是生产重组蛋白和抗体的优先选择，而且许多细菌已经被很好地研究利用。原核蛋白表达系统是常用的表达系统，在大量细菌中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌细胞系是常用的重组蛋白表达宿主，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌可以在适宜条件下以很低的成本快速复制，而且表达水平高，这种特性使其成为大规模生产的有效和经济的方式。此外，他们的基因组已完全测序，遗传背景和代谢途径众所周知。另外，由于结构简单，细菌比真核生物更容易转染。这些优势特征使表达过程更容易和更快速。

但在某些方面，原核蛋白表达系统也有其局限性。虽然，可以利用细菌比较容易地表达具有少量修饰的蛋白质，但需要考虑到细菌中没有细胞核，高尔基体和内质网。而这些结构在细胞运输和翻译后修饰（PTM）过程中是必需的。因此，细菌表达系统不能表达膜结合蛋白，例如胰岛素受体、血型糖蛋白以及某些酶等。由于很多蛋白质在正确折叠中需要这种修饰，而细菌无法完成修饰，导致细菌中产生的很多蛋白质是无活性的并且不起作用。由此看来，客户必须根据蛋白质的结构和功能特性选择合适的蛋白表达系统。

 

服务内容 

百欧泰生物具有多种表达宿主菌，客户可以根据实际需要，选用不同融合标签蛋白、不同抗性、不同作用元件的表达载体和不同性质的表达宿主。本公司可提供的服务包括以下几类，客户可以提供目的基因序列或建好的表达质粒，本公司提供一站式基因合成和蛋白表达与纯化服务或重组蛋白表达与纯化服务。

 

 

实验原理

在原核蛋白表达体系中，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，以E.coli（大肠杆菌表达系统）为例，使用诱导剂IPTG诱导表达原理如下：

原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动+序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即阻遏蛋白）能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（这里指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用很强的诱导剂，不被细菌代谢且十分稳定，因此实验室使用较多。

 

 

实验步骤

测序验证

序列比对

重组质粒酶切

蛋白表达分析鉴定（11度低温诱导体系）

重组蛋白亲和纯化（Ni亲和树脂一步亲和纯化）

纯化后蛋白Sumo蛋白酶酶切

Sumo蛋白酶酶切后第二次亲和纯化

得到酶切后目的蛋白

 

实验服务流程

双方沟通一致后确定实验方案，确定服务要求-签订合同—预付款-开始实验-成果交付

 

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