发布日期：2017-09-19
现在的基因组编辑工具本身并不能改变基因序列的排布。它们能做的只是在基因组序列上制造几个缺口。而真正改变基因组序列，编辑基因组序列的是细胞本身。
而我们能做的，是最大限度地诱导细胞按照我们的意愿完成基因组编辑。
那么，到底是怎么个诱导方式呢？
咱们从基因敲除说起~
如果我们要进行基因敲除。
最简单但也最放任自流的方式是，在我们需要敲除的基因片段上制造一个切口，让细胞自行进行修补。这个过程中，细胞有可能在缺口上缺失几个碱基，插入几个碱基。如果缺失或插入的碱基不是3的倍数，这个基因就有可能因为移码突变而出现功能缺失，从而实现敲除。我们从这些经过处理的细胞中随机挑选出一些，分别进行单个细胞的培养和扩增。这些由单个细胞扩增形成的细胞群落被称作一个单克隆。用western、PCR等方法分析这些单克隆的基因表达情况，就可以找到那些目的基因被敲除的细胞群落，也就是我们需要构造的基因敲除单克隆细胞系。这些单克隆细胞系的目的基因功能被缺失掉了，但是编码基因的序列仍然被留在基因组里，只不过被破坏了，无法正常表达。
另外一个更可控的方式是我们在这个基因序列距离较远的两个位点上分别制造一个切口，两个切口间的大片段极有可能因此被删除。我们可以筛选出这些发生大片段删除的单克隆。它们的目的基因几乎可以从基因组中完全删除。但是这种方法需要挑更多的单克隆进行验证，因为两个位点同时被切割的概率比单位点被切割的概率更低。
前面讲的这两种方法都需要随机挑取单克隆进行验证。这个有点靠运气。
有一个办法可以让我们的单克隆挑选更有目的性，那就是给咱们被编辑细胞加标记。
比如gfp荧光蛋白？抗性基因等等，在它们的两边加上目的基因序列的同源臂做成标签序列。把它们放进细胞的同时，也放进去一些基因组编辑工具，在目的序列上制造缺口，增加同源重组的概率，把这些标签给整合进去目的基因序列里。而这样的大片段插入可以同时破坏目的基因的表达，造成其功能缺失。这样我们就可以通过抗性筛选，或者基于荧光表达的筛选等找到我们的基因敲除细胞，一举两得。
来源：博雅辑因科技（微信号 EdigeneTech）
